附件：人Septin 9基因甲基化檢測試劑非臨床研究審評要點（2025年第15號）.doc

人Septin 9基因甲基化檢測試劑
非臨床研究審評要點

本審評要點主要針對人Septin 9基因甲基化檢測試劑的分析性能、陽性判斷值、穩(wěn)定性、主要原材料及生產(chǎn)工藝等研究過程，為體外診斷試劑注冊申請人和技術(shù)審評部門提供參考。

本審評要點是對人Septin 9基因甲基化檢測試劑的一般要求，注冊申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本審評要點是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本審評要點。如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本審評要點是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術(shù)的不斷發(fā)展，相關內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

本審評要點適用于采用實時熒光PCR法，對人外周血血漿中Septin 9基因的甲基化進行體外定性檢測的試劑。可用于臨床結(jié)直腸癌疑似患者的輔助診斷。

Septin系列基因是一類具有三磷酸鳥苷活性的保守基因家族，參與多種生物過程。Septin 9是Septin家族的一員，廣泛存在于人類細胞中，位于17q25.3，含有17個外顯子，存在多個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。甲基化的Septin 9基因是結(jié)直腸癌早期發(fā)生、發(fā)展過程中的分子標志物之一。

對于Septin 9基因甲基化與其他標志物聯(lián)合檢測的試劑，應結(jié)合適用的預期人群、樣本類型、臨床適應癥等，針對聯(lián)合檢測的非臨床性能進行充分研究。

對基于其他樣本類型、方法學或檢測靶標的試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，注冊申請人可以參照本審評要點，根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進行評價或補充其他的評價資料進行相應驗證。

本審評要點適用于進行產(chǎn)品注冊和變更注冊申報的產(chǎn)品。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關法規(guī)的要求，如Septin 9基因甲基化檢測試劑盒（PCR熒光探針法）。按照《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.注冊申請人還需提交產(chǎn)品列表、關聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

內(nèi)容應符合《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》的相關要求，主要包括概述、產(chǎn)品描述、預期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。建議申請人著重介紹以下幾方面內(nèi)容：

1.產(chǎn)品描述中應詳述檢測原理、血漿游離DNA 提取方法原理、甲基化檢測原理、DNA轉(zhuǎn)化原理、PCR檢測原理，此外描述引物探針設計原則及其與檢測位點的對應關系，檢測基因及甲基化位點信息、篩選過程、選擇依據(jù)以及結(jié)果判斷方法等，提交文獻依據(jù)。介紹靶基因及其其甲基化的生物學特征及臨床意義，提交文獻依據(jù)。明確內(nèi)標與質(zhì)控的設置和選擇依據(jù)，如有防污染措施，需描述防污染的原理。

2.與同類和/或前代產(chǎn)品的比較，應著重從方法學、檢驗原理、樣本類型、檢測的基因名稱、引物覆蓋的檢測區(qū)段、探針覆蓋的甲基化位點、組成成分、內(nèi)標、質(zhì)控物、判讀規(guī)則、分析性能、臨床性能以及臨床用途、適用人群等方面詳細說明申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批同類產(chǎn)品之間的異同，如需聯(lián)合其他基因甲基化實現(xiàn)預期用途，同時需比較聯(lián)合檢測的靶標單獨和組合信息，并明確申報產(chǎn)品組合特征與患者受益情況。

3.預期用途需明確適用人群、樣本類型、基因名稱、檢測的甲基化位點、基因區(qū)段及臨床用途。需提交臨床適應癥的發(fā)病原因、臨床癥狀、流行病學特征、該疾病相關篩查、診斷及有效治療方法，明確現(xiàn)有方法臨床應用的優(yōu)缺點。詳述檢測靶點與預期用途之間的關系，提供相關指南或權(quán)威文獻。描述Septin 9基因在腫瘤不同分期組織中的甲基化狀態(tài)以及在其他腫瘤及非腫瘤組織中的甲基化狀態(tài)，提供參考文獻。

4. Septin 9基因的甲基化檢測如需結(jié)合其他檢測試劑共同實現(xiàn)預期用途，需提交聯(lián)合使用的檢測試劑盒的上市信息，并提供具體的被測基因、位點、檢驗原理、檢測方法、陽性判斷值及結(jié)果判讀方法等信息。整個檢測系統(tǒng)應已定型。

（三）非臨床資料

1.產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

1.1 產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及有關文獻資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導原則》（2022年第8號）的要求編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應將主要原材料及生產(chǎn)工藝要求等內(nèi)容作為附錄附于產(chǎn)品技術(shù)要求正文后。

如有適用的國家標準、行業(yè)標準，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關要求應不低于相應的要求。

1.2產(chǎn)品檢驗報告

根據(jù)《體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》的要求，申請人應當提供三個不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗報告，有適用的國家標準品，應當使用國家標準品對產(chǎn)品進行檢驗。報告形式可為申請人出具的自檢報告或委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)出具的檢驗報告。申請人開展自檢的，應當符合《醫(yī)療器械注冊自檢管理規(guī)定》及相關法規(guī)的要求。

2.分析性能研究

注冊申請人應當在原材料和生產(chǎn)工藝經(jīng)過選擇和確認、質(zhì)量管理體系得到有效控制并且保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的基礎上，采用完整、確定的檢測系統(tǒng)進行分析性能評估，包括具體研究方法、質(zhì)控標準、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。對于本類產(chǎn)品建議著重對以下分析性能進行研究：

如試劑用于不同適用機型，需要在不同機型上分別進行性能評估。

每項性能評估應盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本進行研究。不同樣本類型應分別進行研究。

分析性能評估內(nèi)容包括樣本穩(wěn)定性、適用樣本類型、DNA提取/純化性能及甲基化DNA轉(zhuǎn)化性能、準確度、精密度、檢出限、特異性、反應體系等研究。

2.1樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性可包括樣本處理不同階段的樣本穩(wěn)定性研究，一般包括樣本各種實際運輸及儲存（常溫、冷藏和冷凍）條件下的保存期限驗證，以確認樣本的保存條件及保存時間。可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行驗證，從而確認不同類型樣本的穩(wěn)定性。可冷凍保存的樣本還應對凍融次數(shù)進行合理驗證。應明確具體的保存溫度范圍。

如核酸提取產(chǎn)物可保存，還需對核酸提取產(chǎn)物的保存條件和保存時間進行研究。

如甲基化DNA轉(zhuǎn)化后的樣本可保存，需提交轉(zhuǎn)化后的樣本穩(wěn)定性研究資料。

2.2適用樣本類型

明確適用的樣本類型。如有不同樣本類型或適用于不同抗凝劑，需提交樣本類型適用的研究資料。

2.3 DNA提取/純化性能及甲基化DNA轉(zhuǎn)化性能

在進行DNA甲基化檢測前，應有適當?shù)暮怂崽崛?純化步驟。應根據(jù)樣本類型、檢測目的選擇DNA提取純化方法。無論檢測試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請人都應對配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度、DNA完整性進行評估，此外需結(jié)合試劑對檢出限、重復性、抗干擾性能等進行充分的驗證，并評價該方法能否滿足該類產(chǎn)品的要求。循環(huán)游離DNA（circlulating cell-free DNA，cfDNA）的提取純化和處理應考慮避免基因組DNA的污染。不同樣本類型應分別進行核酸提取/純化性能的研究驗證，根據(jù)樣本類型制定質(zhì)量合格標準并進行評價。應采用真實適用樣本進行提取效率的研究。

DNA甲基化檢測需要針對不同的樣本類型與檢測應用選擇適宜的轉(zhuǎn)化方法。對于通過重亞硫酸鹽處理DNA的情形，應提交重亞硫酸鹽處理試劑的篩選研究、不同甲基化比例的樣本的轉(zhuǎn)化效率研究、DNA的回收效率等性能研究，設定相應的質(zhì)量標準。

2.4準確度

采用申報產(chǎn)品和對比方法對經(jīng)臨床診斷確定后的不同核酸濃度和甲基化水平臨床樣本進行平行檢測，評估申報產(chǎn)品的準確度。應包括一定數(shù)量的陽性和陰性及干擾樣本。

2.5精密度

使用不同濃度和不同甲基化比例的臨床樣本，采用三批試劑對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，應考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應包含核酸提取/純化及甲基化DNA轉(zhuǎn)化步驟。

2.6檢出限

檢出限研究的目的是考察在一定量的適用樣本DNA濃度背景下能夠檢測的甲基化陽性樣本最低比例，該背景DNA濃度建議參考患者血漿cfDNA濃度 。

2.6.1檢出限的確定

對不同DNA濃度下含有不同比例甲基化DNA的樣本進行檢測，確定樣本的檢出限。可使用不同濃度、不同甲基化比例的模擬樣本進行研究，采用臨床陰性基質(zhì)進行稀釋，每濃度梯度使用三批試劑分別在適用機型上檢測至少20次，將檢出率大于等于95%的最低濃度水平確定為檢出限。也可選用其他合理方法進行檢出限的建立。

2.6.2檢出限的驗證

檢測限的驗證可使用三批試劑在適用機型上對檢出限濃度水平的臨床樣本檢測至少20次，陽性檢出率應不低于95%。檢出限可表示為xx濃度的野生型DNA背景下*%的Septin 9甲基化DNA。

2.7 特異性

2.7.1交叉反應

應考慮含非目標基因甲基化的其他甲基化基因、Septin 9基因擴增片段SNP位點、非甲基化Septin 9基因等對檢測結(jié)果的影響。

特異性驗證樣本包括可轉(zhuǎn)移到結(jié)直腸的其他原位癌種、其他常見癌種（對于結(jié)直腸癌輔助診斷預期用途，包含但不限于其他消化道癌種等）以及其他良性疾病（如息肉、痔瘡、胃腸道間質(zhì)瘤等）相關基因甲基化陽性的人血漿樣本。若有交叉反應，應進行風險分析。

2.7.2 干擾試驗

應針對可能的內(nèi)源和外源性干擾物，采用弱陽性樣本對高濃度干擾物質(zhì)進行干擾試驗研究。內(nèi)源性干擾物包括脂肪酸、甘油三酯、膽固醇、血紅蛋白、血紅素、膽紅素等。藥物包括胃腸道疾病常用藥物、抗生素（如阿莫西林、甲硝唑、頭孢曲松鈉、左氧氟沙星等）、對乙酰氨基酚、質(zhì)子泵抑制劑（如奧美拉唑等）、胃粘膜保護劑（如硫糖鋁等）、胃腸道動力藥（如嗎丁啉等）、H2受體拮抗劑(如西咪替丁等）、降血脂藥（他汀類）、降血壓藥等。

對多重PCR反應體系中的不同檢測靶標間的相互干擾進行研究。

2.8反應體系

2.8.1 確定最佳反應體系的研究資料，包括甲基化DNA轉(zhuǎn)化用核酸樣本體積，甲基化DNA轉(zhuǎn)化反應體系及反應條件（如涉及），反應體系中的加樣量、試劑用量、反應體系各成分終濃度(如酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等)。對于多重PCR反應體系，應針對靶標與內(nèi)標的擴增效率及相互影響進行充分研究。

2.8.2提供PCR反應各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)、熒光采集時間的研究資料。

2.8.3 提供不同機型基線、閾值、閾值循環(huán)數(shù)（Ct）、熒光強度確定的研究資料。

2.8.4 提供質(zhì)控體系設置、Ct值確定的研究資料。

2.8.5 不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

2.8.6 如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行優(yōu)化的研究資料。研究確定最佳核酸提取反應體系，包括核酸提取使用的樣本體積、洗脫體積、離心條件等。

3.穩(wěn)定性

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、使用穩(wěn)定性（如開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性（如適用）、機載穩(wěn)定性（如適用）等）、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)限制（如適用）研究等。申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。

實時穩(wěn)定性研究應采用至少三批試劑在實際儲存條件下保存至成品有效期后，選取多個時間點進行產(chǎn)品穩(wěn)定性研究。

4.陽性判斷值

建議申請人納入一定數(shù)量的臨床樣本，結(jié)合產(chǎn)品特性可采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法確定靶標基因陽性判斷值。采用臨床來源的未經(jīng)治療的樣本，根據(jù)預期用途可納入目標癌種、癌前病變、其他需鑒別診斷的惡性腫瘤、良性疾病等樣本進行陽性判斷值研究，包括不同病理類型、不同的分期、不同甲基化比例及陽性判斷值附近的樣本，并對不同分期分別進行統(tǒng)計。

提交內(nèi)標基因的Ct值確定研究資料，可采用百分位數(shù)法確定內(nèi)標基因的Ct值范圍。

申請人應詳細闡述所采用方法的選擇依據(jù)，提交詳細研究方案、建立和驗證設計、試驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析過程。明確所用樣本類型、樣本來源、樣本量估算的方法、樣本例數(shù)、臨床背景信息、基因甲基化確認過程及數(shù)據(jù)等信息。臨床背景信息至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

如試劑判讀存在灰區(qū)，應提交灰區(qū)范圍確定的研究資料。

5.其他資料

5.1主要原材料研究資料

主要原材料研究資料通常可包括核酸提取試劑/純化試劑、DNA轉(zhuǎn)化試劑、DNA捕獲序列（如有）、引物、探針、DNA聚合酶、UNG酶（如有）、dNTP等，此外還包括對照品/質(zhì)控品及企業(yè)參考品。申請人應提交相關原材料的來源、選擇、制備方法的研究資料，質(zhì)量分析證書，質(zhì)量標準的制定和檢驗資料。如為申請人自制，應提供其詳細制備過程；如為外購，還應提交生產(chǎn)商篩選資料以及生產(chǎn)商提供的原材料質(zhì)量檢定報告。

5.1.1核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。如產(chǎn)品不包含提取試劑，則需明確配套的核酸提取/純化試劑并提交相應的提取效率驗證資料。

5.1.2 DNA轉(zhuǎn)化試劑，明確主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。如產(chǎn)品不包含DNA轉(zhuǎn)化試劑，則需明確配套的DNA轉(zhuǎn)化試劑并提交相應的轉(zhuǎn)化性能驗證資料。

5.1.3 引物、探針

注冊申請人應詳述Septin 9基因及內(nèi)標基因（如適用）、引物、探針的設計原則，擴增區(qū)段，檢測覆蓋的甲基化位點及其所在基因位置并提供選擇依據(jù)，同時應提供捕獲序列、引物、探針核酸序列及其對應的轉(zhuǎn)化前后基因序列及對應關系，明確相應的甲基化與非甲基化位點。提交詳細的篩選研究數(shù)據(jù)。

注冊申請人應針對選定的引物探針原材料進行質(zhì)量評價，一般包括：序列準確度、純度（HPLC純等）、濃度、探針熒光標記基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長（如適用）以及功能性試驗等。注冊申請人應明確評價方法，并依據(jù)評價結(jié)果建立合理的質(zhì)量標準。

5.1.4酶

酶包括DNA聚合酶和/或尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請人應針對各種酶的活性進行驗證，提交功能性試驗資料，并確定酶的質(zhì)量標準。如有降低Taq酶非特異性擴增的措施，需詳細描述（例如采用熱啟動酶，Taq抗體等）。

DNA聚合酶應具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具有5’-3’外切酶活性（如適用），具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

5.1.5脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應提交對其純度、濃度等的驗證資料，以及功能性試驗資料，并確定質(zhì)量標準。

5.1.6對照品/質(zhì)控品

注冊申請人應根據(jù)試劑檢測原理設置各種對照品（質(zhì)控品）來實現(xiàn)對產(chǎn)品整個反應體系的有效監(jiān)控。陰性和陽性質(zhì)控品一般為一定濃度的甲基化陰性和陽性樣本。空白對照為不含靶核酸的溶液。對照品應參與樣本核酸的平行提取。注冊申請人應提供對照品原料選擇、制備、基因序列確認、拷貝數(shù)及濃度確定過程、內(nèi)參基因與靶基因的比例確定等的詳細研究數(shù)據(jù)，并對其檢測結(jié)果做出明確的范圍要求。

注冊申請人應對管內(nèi)抑制導致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，明確所采取的具體措施（如設置內(nèi)標等）、選擇依據(jù)，并提交相應研究資料。

5.1.7企業(yè)參考品

企業(yè)參考品可包括Septin 9基因甲基化陽性參考品、Septin 9基因甲基化陰性參考品、精密度參考品、檢出限參考品。注冊申請人應提交企業(yè)參考品的具體組成、原料來源、選擇、制備方法、陰陽性或甲基化狀態(tài)確認、DNA濃度確認以及檢驗標準等的詳細研究資料。可采用臨床樣本或來源于細胞系片段化DNA樣本。Septin 9基因相應位點甲基化陽性以及Septin 9基因相應位點甲基化陰性樣本作為原料進行參考品的制備，樣本應明確其來源及甲基化狀態(tài)，并提交確認資料。若采用細胞系，如為自制，需提交詳細的細胞系構(gòu)建資料及確認資料；如為外購，應提供生產(chǎn)商名稱、細胞系名稱、細胞類型、基因型信息及確認資料，并提供生產(chǎn)商提供的質(zhì)檢報告。

陽性參考品應包括不同DNA濃度以及一定 DNA 濃度下不同甲基化 Septin 9基因比率的樣本；

陰性參考品為一定 DNA 濃度下不含甲基化Septin 9 基因、含有低于檢出限的甲基化Septin 9基因、含有其他基因甲基化以及含有不同干擾和交叉反應成分的樣本。

精密度參考品應至少包括低、中高不同DNA濃度及在一定濃度下Septin 9基因甲基化陰性、低甲基化比例、中高甲基化比例的樣本。

檢出限參考品：應包括DNA濃度和Septin 9基因甲基化比例均處于檢出限水平的樣本。

5.2 生產(chǎn)工藝

介紹產(chǎn)品的主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述，提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。